1．模板因素：（1）模板中含有杂蛋白；（2）模板中含有Taq酶抑制剂；（3）模板中蛋白质残留，特别是染色体中的组蛋 白残留；（4）提取制备模板时丢失过多；（5）模板核酸变性不彻底。模板因素引起假阴性解决方案：1.配制有效而稳定的消化处理液;2.提取程序固定,不宜随意改动；3.模板DNA的溶解液应固定不变。
2．酶失活：1.酶本身的质量问题(供应商的问题）；2.酶存放时间太长；3.酶存放方式不当，或其他意外原因；4.忘记添加Taq酶。酶失活引起假阴性解决方案：1.检查加样程序及过程，看是否忘记加Taq酶；2.更换新的Taq酶;3.新旧两种Taq酶同时使用。
3．引物：1.引物质量；2.引物浓度；3.两条引物的浓度是否对称等。引物引起假阴性解决方案:1.选定一个好的引物合成单位;2.引物浓度不仅要看OD值，稀释时更要平衡其摩尔浓度；3.引物应高浓度小量分装保存，防止反复冻融或长期冷冻保存，导致引物的变质降解失效，也可要求合成单位将固体分装；4.引物设计不合理，如长度不够，引物本身或两条引物之间形成二聚体等。
4．Mg2+浓度：Mg2+浓度对PCR扩增效率影响极大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性；浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，出现假阴性。
5．反应体积的改变：做小体积PCR后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，而非简单地将反应体系中的各个成分加大几倍，否则易失败。
6．物理原因：1.变性温度低，变性时间短；2.退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率；3.延伸时间过短等。
7．靶序列变异：靶序列变异导致假引性的情况常常发生在靶序列变异正好发生于特异性引物与之结合部的中间，使引物失效。解决方案：根据已知序列重新选择区段设计引物。www.0451jiajiaowang.com 哈尔滨家教
1增效PCR（booster PCR）：当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增.消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15~20个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。
2)巢式PCR（nest PCR）此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。 除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。
3)多重PCR 在同一PCR体系中加入若干对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。
4）RT-PCR RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ng~μg水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。
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