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采编:哈尔滨家教网   来源: 哈尔滨家教信息网www.0451jiajiaowang.com   点击:1544    发布日期:2014/2/24 0:38:15

PCR即聚合酶链反应技术

        PCR即聚合酶链反应技术,是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用,通过变性-延伸-复性的循环操作,在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。温度时间及循环数是如何控制的:

  PCR变性(9430s) 退火(Tm—550s) 延伸(7240s) 保温 (7210min

其中 Tm=4G+C+2A+T

1变性温度与时间:双链DNA90—95度变性,1min若低于93度则要延长时间,温度不能过高,E活性受影响,主要取决于GC含量,G+C含量越高,则温度越高,所需时间与DNA分子的长度相关,分子越长,则变性时间越长

2退火温度与时间

一般为40-60度,30-60s,取决于引物的长度,碱基组成及其浓度,还有靶序列长度,可通过公式计算   T=Tm—510=4G+C+2A+T—5  在Tm值允许的范围内,选择较高温度可大大减少引物与模板间的非特异性结合

3延伸温度与时间,一般选择在70-75之间,常用72过高的延伸温度不利于引物和模板的结合哈尔滨家教  www.0451jiajiaowang.com

延伸时间可根据待扩增片段的长度而定,一般1Rb以内的DNA片段延伸1min足够,3-4kb需要3-4min,扩增10kb,则需要延伸15min,延伸时间过长会导致特异性条带的出现,对低浓度的扩增,延伸时间要稍长一些

4循环次数主要取决于模板的浓度,一般为25-40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量随之增多

原理合成待扩增区域两端已知序列,与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物,引物的序列决定扩增片段的长度;

PCR体系基本组成成分:模板DNA  特异性引物   耐热DNA聚合酶  dNTPs  Mg2+  

1、引物设计原则

1)引物的特异性 2)避开产物的二级结构区 3)长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp,一般为20~27mer 4G+C含量 一般为40%~60%Tm=4G+C+2A+T

5)碱基础随机分布:3′端不应超过3个连续的GC 6)引物自身,引物之间无二级结构
8)引物的3′端:不可以修饰 9)引物的5′端:可以被修饰,包括:加酶切位点;标记         生物素、荧光、地高辛。10)密码子的简并

PCR的主要用途:目的基因的克隆;基因的体外突变;DNARNA的微量分析;DNA序列测定;基因突变分析;


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