PCR即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。温度时间及循环数是如何控制的：
PCR变性（94℃，30s） 退火（Tm—5℃，50s） 延伸（72℃，40s） 保温 （72℃，10min）
其中 Tm=4（G+C）+2（A+T）
1变性温度与时间：双链DNA在90—95度变性，1min若低于93度则要延长时间，温度不能过高，E活性受影响，主要取决于GC含量，G+C含量越高，则温度越高，所需时间与DNA分子的长度相关，分子越长，则变性时间越长
2退火温度与时间
一般为40-60度，30-60s，取决于引物的长度，碱基组成及其浓度，还有靶序列长度，可通过公式计算 T=Tm—（5℃～10℃）=4（G+C）+2（A+T）—5℃ 在Tm值允许的范围内，选择较高温度可大大减少引物与模板间的非特异性结合
3延伸温度与时间，一般选择在70-75℃之间，常用72℃过高的延伸温度不利于引物和模板的结合哈尔滨家教 www.0451jiajiaowang.com
延伸时间可根据待扩增片段的长度而定，一般1Rb以内的DNA片段延伸1min足够，3-4kb需要3-4min，扩增10kb，则需要延伸15min，延伸时间过长会导致特异性条带的出现，对低浓度的扩增，延伸时间要稍长一些
4循环次数主要取决于模板的浓度，一般为25-40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量随之增多
原理：合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度；
PCR体系基本组成成分：模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
1、引物设计原则
1）引物的特异性 2）避开产物的二级结构区 3）长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。 4）G+C含量 一般为40%~60%。Tm=4（G+C）+2（A+T）
5）碱基础随机分布：3′端不应超过3个连续的G或C 6）引物自身，引物之间无二级结构
8）引物的3′端：不可以修饰 9）引物的5′端：可以被修饰，包括：加酶切位点；标记 生物素、荧光、地高辛。10）密码子的简并
PCR的主要用途：目的基因的克隆；基因的体外突变；DNA和RNA的微量分析；DNA序列测定；基因突变分析；
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